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      瓜爾豆膠產品中心 / Product Center

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      三種親和層析體系純化大豆凝集素的比較研究

      發布日期:2015-05-22 10:49:14
      純化
      大豆凝集素(Soybean Agglutinin,SBA)是指大 豆中能與N—乙?;籇—半乳糖胺/半乳糖胺/半 乳糖特異性結合的糖蛋白,分子量約120kDa,由純化四個略有不同的亞基構成四聚體,每個亞基分子量約 30kDa,在超速離心中隨7S蛋白一起沉降自上 世紀中葉SBA被首次發現并命名以來,由于其具有 特殊的生物學功能(與游離的N—乙?;籇~?半 乳糖胺/半乳糖或細胞膜糖蛋白上的N_乙?;?D—半乳糖胺/半乳糖結合),如今在抗營養作用、選 擇性分離骨髓干細胞、分離糖蛋白、靶向給藥、植物 分類學及人類血型鑒定等方面的研究越來越多。
       
      獲得高純度的SBA是進行上述研究的前提。 提取和純化SBA的方法較多,最初采用鹽析、移動 界面電泳結合超速離心沉淀技術,但只能得到少量的SBAM,后來又發展了離子交換和磷酸鈣層析 法[3<,而應用上述SBA的特殊生物學功能進行親 和層析是近年來普遍采用的方法。其中最常用的親 和層析體系是N—乙?;籇_半乳糖胺一epoxy 一 Sepharose 6B[5’S]、半乳糖胺一CH — Sepharose 4B[6W和瓜爾膠但這三種方法沒有系統的研究, 本實驗旨在比較三種親和層析體系的差異,并確定 其中的最佳方法,以大量提取SBA,進而用于抗營 養研究。
       
      1材料與方法1.1材料1.1.1試驗樣品三種親和層析凝膠(N —乙?;籇—半乳糖胺一epoxy —Sepharose 6B、半乳糖 胺一CH—Sepharose 4B和瓜爾膠)均購自Sigma公 司;大豆(豐交7607)購于吉林省春雨種子有限公 司。
       
      1.1.2 主要試劑 SBA標準品購自Sigma公 司;硫酸銨、半乳糖等均為國產分析純。
       
      1.2.3主要儀器低溫高速離心機(Sigma公司)、85—2磁力攪拌機(江蘇金壇市金城國勝實驗 儀器廠)、UV—2102PCS紫外可見光分光光度計 (龍尼柯儀器有限公司)、恒溫水浴(哈爾濱市東聯電 子技術開發有限公司)、BS —160型自動收集器(上 海滬西分析儀器廠)、PHS—3C型酸度計(上海偉業 儀器廠)等。
       
      1.2方法1.2.1SBA粗提液的制備 稱取生大豆100g, 粉碎過40 0標準篩,置于500mL低沸石油醚(餾程 3CTC?60‘C)內攪拌提取4h脫脂,晾干。用磷酸緩 沖液(PBS,0. 01mol/L,pH7. 6)4’C 下浸提過夜。 lOOOOr/m離心20min,棄沉淀。上清液中加入固體 硫酸銨至85%飽和度,4'C下攪拌2h,1000〇r/m離 心20min,棄上清。沉淀溶于PBS,并用PBS透析 過夜,離心除去少量雜質,上淸即為SBA粗提液。
       
      1.2.2SBA的純化 N—乙?;籇—半乳糖 胺一epoxy — Sepharose 6B、半乳糖胺一CH — Seph?arose 4B 和瓜爾膠均 PBS 平衡處理后,前兩種凝膠 分別裝入1. 5 X 15cm的層析柱中,后者裝人3 X 40cm的層析柱中。將SBA粗提液分批加人各柱, 用PBS洗去雜蛋白,反復幾次,直至使凝膠的親和 能力達到飽和(洗脫液中測不出SBA)。至流洗液OD2Mnm<0. 01?后。換用含 0. ImoVLD-半乳糖 (半乳糖胺一CH-Sepharose 4B和瓜爾膠)或〇。 15m〇l/LD-半乳糖(N-乙?;籇—半乳糖胺一 epoxy—Sepharose 6B)的 PBS 洗脫,流速為 0. 5 mL/min(半乳糖胺一CH —Sepharose 4B和瓜爾膠) 或0. 8 mL/min(N—乙丑基一D—半乳糖胺一epoxy —Sepharose 6B),分管收集并合并 OD2Mnm>0. 1 的洗脫峰各管,即為純化的SBA。
       
      1.2.3SBA的含量測定以紫外吸收法測定SBA的含量。
       
      1.2.4SBA的活性檢測以兔紅細胞凝集試驗檢測SBA的活性。按紅細胞的凝集強度,以+ + + + (強凝集)、+ +十、+ +、+和一(不凝集)表示,以 出現+ +的SBA最高稀釋倍數為凝集效價。
       
      1.2.5SBA的純度鑒定用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)對所提取的SBA進行純度 分析。
       
      2結果與分析圖1 N—乙丑基一D—半乳糖胺一epoxy — Sepha- rose 6B和半乳糖胺一CH—Sepharose 4B體系 純化大豆凝集素曲線Fig. 1 Elution curve of SBA purification with Gal- NAc—epoxy — Sepharose 6B and GalNH2 — CH~ Sepharose 4B system由圖1可見,半乳糖胺一CH —Sepharose 4B的 雜蛋白洗脫峰較N—乙?;籇—半乳糖胺一epoxy -Sepharose 6B略早,而且蜂值高。這是由于N-乙 ?;鵢D—半乳糖胺對SBA的親和力遠大于半乳糖王利民等:三種親和層析體系純化大豆凝集素的比較研究1期胺對SBA的親和力。瓜爾膠層析柱的體積大,與 SBA的親和力小,故兩個峰收集的管數都較多,雜蛋 白洗脫峰值高,而SBA洗脫峰值低(圖2、圖3)。
       
      2.2SBA產率及親和飽和度根據純化后SBA的終濃度和收集的總體積,計 算出其產率,即每l〇〇g生大豆經三種親和層析柱純 化后所得的SBA。親和飽和度即每次上樣后當層 53 析柱對SBA的結合達到最大時,每毫升凝膠所能結 合的SBA量。由表1可見,三種親和體系中,N— 乙?;籇—半乳糖胺一epoxy — Sepharose 6B的 產率最高,其次是瓜爾膠和半乳糖胺_CH—Sepha- r〇se4B,后二者差異不顯著。三者的親和飽和度差 異均較顯著。
       
      —>—005 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 洗脫體積(試管數)Elution volume ( No. of tubes )
       
      圖2瓜爾膠體系純化大豆凝集素雜蛋白洗脫曲線 Fig. 2 Non—aimed protein elution curve of SBA purification with Guar system5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 洗脫體積(試管數)Elution volume ( No. of tubes )
       
      圖3瓜爾膠體系純化大豆凝集素目的蛋白洗脫曲線 Fig. 3 Aimed protein elution curve of SBA purifica?tion with Guar system表1三種親和層析體系的大豆凝集素產率和親和飽和度比較12. 2 士 1.47. 5 士 1.3 2.1 士 1.6147.0士 15110.0士 12128.0士 16大豆凝集素SBA產率(mg/lOOg生大豆)親和飽和度(mg/mL凝膠)
       
      Production rateAbsorbing capacityN—乙丑基一D—半乳糖胺一epoxy—Sepharose 6B GalNAc-epoxy—Sepharose 6B 半乳糖胺 _CH—Sepharose 4B GalNH2 — CH—Sepharose 4B 瓜爾膠Guar項目ItemTable 1 Comparison of production rate and absorbing capacity of SBA among the three affinity systems表2三種親和層析體系純化的大豆凝集素血凝效價比較Table 2 Comparison of agglutinating red blood cell effect of SBA among the three affinity systemsas P 件rmSample1* 24SBA 稀釋倍數 Dilution times of SBA 8 16 32 64 1282565121024SBA標準品Standard sample+++++++++++++ + ++ + ++ + ++ + ++ ++ ++十純化樣品1Purified sample1++十十++++十十+++ +十+ + ++ + ++ ++ ++ ++十純化樣品2Purified sample2+ + + + 十+ ++ + ++ + ++ + ++ + ++ ++ +++純化樣品3Purified sample3+ + + ++ + ++ + ++ + ++ + ++ ++ ++ +++注*1、2、3分別代表N—乙?;籇_半乳糖胺一epoxy—Sepharose 6B、半乳糖胺一CH—Sepharose 4B和瓜爾多糖凝膠純化的SBA. *為SBA的起始濃度(lmg/mL)aNote:l ,2,3means SBA made by GalNAc—epoxy—Sepharose 6B, GalNHg—CH —Sepharose 4B and Guar gel.
       
      * Indicates the initial concentration of SBAClmg /mL).
       
      2.3 SBA的純度由圖4可見,三種親和層析體系純化的SBA'與 標準SBA的電泳結果一致,分子量約為30KDa,而 且沒有任何雜蛋白帶,表明所純化的SBA純度較 高。此結果與LotanW的報道一致。
       
      2.4SBA的生物活性由表2可見,本試驗中SBA的凝集效價均為 256。三種親和層析體系純化的SBA的效價與購買 的SBA標準樣品沒有顯著差異。
       
      雖然三種純化體系都是親和層析,但固相載體 上所連的配基不同,因而對SBA的特異性親和力也 不同。N_乙?;籇—半乳糖胺和半乳糖胺兩種 配基分別以化學方法共價結合于作為固相“支架” epoxy—Sepharose 6B(環氧活化的瓊脂糖凝膠6B) 和CH — Sepharose 4B(羧基瓊臘糖凝膠4B)上,且 CH —Sepharose 4B 的結構較 epoxy—Sepharose 6B 疏松[1°],因而等量的體凝膠積,epoxy — Sepharose 6B結合N—乙?;籇—半乳糖胺的位點多于CH —Sepharose 4B結合半乳糖胺的位點。而且N—乙 ?;籇—半乳糖胺對SBA的親和力又是半乳糖 胺對SBA的親和力的30倍[11],因此該體系的SBA 洗脫峰、產率和親和飽和度都髙于半乳糖胺一CH_ Sepharose 4B體系。由于兩種配基對SBA的特異 性親和力不同,所以這兩種體系所用半乳糖洗脫液 的濃度和流速也不同。
       
      瓜爾膠是主要(約80%)由半乳糖和甘露糖聚 合而成的天然半乳多縮甘露聚糖,由原產于非洲的 一種豆科草本植物瓜爾豆種子的胚乳加工精制而成 的天然植物膠,為大分子天然親水膠體。本試驗顯1期示,天然瓜爾膠對SBA的特異性親和能力只有N_ 乙丑基一D — 半乳糖胺一epoxy—Sepharose 613的 約1/6、半乳糖胺一CH — Sepharose 4B的約1/3,說 明SBA對半乳糖的親和力遠不如半乳糖胺和N — 乙?;籇—半乳糖胺。
       
      綜上所述,用親和層析法純化大豆凝集素的最 理想方法是N—乙丑基一D—半乳糖胺_epoxy— Sepharose 6B體系,但價格較貴。瓜爾膠成本較低, 但產率也低。
       
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